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FITC标记抗体的方法


 

FITC标记抗体的方法

 

异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate, FITC 

纯品为黄色或橙黄色结晶粉末,易溶于水和酒精溶剂。有两种异构体,其中异构体Ⅰ型在效率、稳定性与蛋白质结合力等方面都更优良。FITC分子量为389.4,吸取光波长为490495nm,发射光波长为525530nm,呈现明亮的黄绿色荧光。FITC在冷暗干燥处可保存多年,是目前应用*广泛的荧光素。其主要优点是人眼对黄绿色较为敏感,通常切片标本中的绿色荧光少于红色。 

FITC 是在荧光素的基础上通过化学反应增加硫氰酸基团得到的,硫氰酸基团可以和生物活性物质例如蛋白质上的伯胺基团反应形成硫脲键,从而实现对生物活性物质的荧光标记。在碱性条件下(pH8.5以上),FITC的异硫酸基在水溶液中与**球蛋白的自由氨基经碳酰胺化而形成硫碳氨基键,成为标记荧光**球蛋白,即荧光抗体。一个Ig分子上*多能标记15~20FITC分子。

 

FITC标记抗体流程: 

1)将待交联的蛋白(浓度≥1mg/ml)对交联反应液透析三次4℃,至pH=9.0。交联反应液配制方法:7.56g NaHCO31.06g Na2CO37.36g NaCl,加水定容至1 L 

2)将FITC溶于DMSO中,浓度为1mg/mL。每次交联使用的FITC均应新鲜配制,避光。 

3)按P:F(蛋白质:FITC=1mg:150μg 的比例将FITC缓慢加入于抗体溶液中,边加边轻轻晃动使其与抗体混合均匀,暗处4 ℃反应8 h 

4)加入5mol/LNH4Cl至终浓度50mmol/L4 ℃终止反应2 h 

5)将交联物在PBS中透析四次以上,至透析液清亮。 

6)交联物的鉴定 

蛋白浓度(mg/mL= [ A2800.31×A495 ] / 1.4 

F/P比例: 3.1×A495 / [A280 0.31×A495 ],该值应介于2.5 ~ 6.5之间。 

7FITC交联的蛋白应置于pH 7.4的磷酸盐缓冲液中,加入0.1% NaN31% BSA4℃避光保存。 储存条件:4℃避光保存 

 

FITC在碱性溶液中与抗体蛋白反应时,主要是蛋白质上赖氨酸的r氨基与荧光素的硫碳胺键(thiocarbmide)结合,形成FITC-蛋白质结合物,即荧光抗体或荧光结合物。一个IgG分子中有86个赖氨酸残基,一般*多能结合1520个,一个IgG分子可结合28个分子的FITC,其反应式如下 

FITC-N=C=S + N-H2-蛋白质 → FITC-NS-C-N-H2-蛋白质 

常用Marsshall1958)法标记荧光抗体,也可以根据条件采用Chadwick等标记法或Clark等(1963)的透析标记法。 

1Marsshall 

1)材料 抗体球蛋白溶液、05molLpH90)碳酸盐缓冲液、无菌生理盐水、异硫氰酸荧光 

素、1%硫柳汞水溶液、50ml小烧杯、4℃冰箱、电磁搅拌器、透析袋、玻棒、pH7230001molLPBS等。 

2)方法及步骤 ①抗体的准备 取适量已知浓度的球蛋白溶液于烧杯中,再加人生理盐水及碳酸盐缓冲液,使*后**球蛋白浓度为20mgml,碳酸盐缓冲液容量为总量的110,混匀,将烧瓴置电磁搅拌器上(速度适当以不起泡沫为宜)510min 

②荧光素的准备 根据欲标记的蛋白质总量,按每毫克**球蛋白加001mg荧光色素,用分析天平准确称取所需的异硫氰酸荧光素粉末。也可用下述公式计算出**球蛋白、荧光素的量,还可以算出需加缓冲液的量。 

a.蛋白溶液:含量Amgm1;容积Bml 

b.总蛋白量(AXB)=Crag 

cC20C10Dmg(如蛋白含量低于20mgml,用C10;如高于20mgml,用C20)。 

d.荧光素FITC的量:(1502100XCEmg 

e.巳05molLpH95)碳酸盐缓冲液D10Fml 

fPBSD-B+F=Gml 

注:A为蛋白含量,mgmlB为蛋白质溶液的容积;C为蛋白总量,mgD为常数,mg;正为荧光素的量,mgF为碳酸盐缓冲液的容积,mlGPBS的容积,ml 

③结合(或标记) 边搅拌边将称取的荧光色素渐渐加入球蛋白溶液中,避免将荧光素粘于烧瓶壁(大约在510min内加完),加完后,继续避光搅拌12h左右。结合期间应保持蛋白溶液于4℃左右,故需将烧杯和搅拌器一起移人4℃冰箱中。 

④透析 结合完毕后,将标记的球蛋白溶液离心(2500rmin20rain,除去其中少量的沉淀物,装入透析袋中,再置于烧杯中,用pH80缓冲盐水透析(04~C)过夜。 

⑤过柱 取透析过夜的标记物,通过葡聚糖凝胶SephadexG-25G50柱,分离游离荧光素,收集标记的荧光抗体进行鉴定。洗脱液:001molL磷酸盐缓冲液(pH72);过滤量:12ml标记全球蛋白液(过滤前未透析);收集量:20ml(稀释17倍左右)。 

2Chadwick 

1)试剂和材料 抗体球蛋白溶液、异硫氰酸荧光素、3%碳酸钠水溶液、001mol/L pH8.0PBS1%硫柳汞、离心机及离心管、烧杯(25ml)搅拌器、无菌吸管,无菌吸管及毛细滴管、烧杯(500ml)透析袋等。 

2)方法及步骤 ①抗体准备 用o4~CpH80磷酸盐缓冲盐水将球蛋白溶液稀释至浓度为3040mgml,置入25ml烧杯内,放于冰槽中。 

②荧光色素准备 按每毫克**球蛋白加入荧光素001rug计算,称取所需的荧光素,用3%碳酸钠水溶液溶解。 

③将准备的抗体与荧光色素溶液等量混合,充分搅匀,在o4~C冰箱中结合(*好在磁力搅拌机上持续搅拌)1824h 

④透析和柱层析 方法同Marsshall法。 

3.改良法 

1)试剂和材料 ①0.01molLpH7.2PBS配法中,校定pH7.2NaCi 18gNa2HP04 1.15g,溶于2000ml蒸馏水 

0.5molLpH9.0)碳酸盐缓冲液配法 取0.5molLNazCOs5.3%)10ml加入0.5molLNaHC034.2%)90ml,混合后,校定pH9.0 

3%碳酸钠水溶液配法 称L 5g无水碳酸钠充分溶解于50ml**蒸馏水中即成。 

④其他试剂和材料 l%叠氮化钠、离心机及离心管、烧杯(25m1)、搅拌器、无菌吸管及毛细滴管、烧杯(500m1)透析袋等。 

2)方法及步骤 ①取高效价的抗人球蛋白兔**血清,分离球蛋白,用盐水(0.15molLNaCl)及缓冲液(0.5molLNaHC03Na2C03pH9.0)稀释使每毫升内含蛋白质lOmg,缓冲液为总量的10%,降温至4℃。 

②加入异硫氰酸盐(FITC)荧光素[蛋白:荧光素=(5080mglmg],在04~C 

下电磁搅拌1214h 

③然后用半饱和的硫酸铵将标记球蛋白沉淀分离,除去未结合的荧光素,再用缓冲盐水透析,除去硫酸铵(用Nessler试剂测验,至隔夜透析的盐水无氨离子及荧光色素为止)。 

④将制备好的荧光抗体加叠氮化钠0.01%,分装在lml安瓿中,或冻干,保存于冰箱中(4℃)可以用半年以上,一20~C保存可达2年以上。 

4.透析标记法

此法适用于小量抗体的荧光素标记,标记简便,非特异性染色较少。 

1)试剂和材料 试剂和材料同改良法。 

2)方法及步骤 ①用0.025molL碳酸盐缓冲液pH90,将欲标记**球蛋白稀释成1%浓度,装入透析袋中。 

②用同一缓冲液将FITC配成0.1mgml的溶液,按10mgml球蛋白溶液体积的10倍,将FITC稀释液盛于圆柱形容器内,并使透析袋浸没于FITC液中。 

③容器顶端盖紧,底部放搅拌棒,在4~C电磁搅拌下透析标记24h。取出透析袋中标记液,即刻用SephadexG50凝胶过滤,去除游离荧光素,分装,贮存于4℃中。

 


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