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上海芃硕生物科技有限企业 主营:PEG修饰剂;荧光染料;生化试剂(酶及酶底物、底物显色剂及色原、辅酶/核苷/碳水化合物、生物缓冲剂和季铵盐、表面活性剂、氨基酸及其衍生物、蛋白质类、维生素类、培养基类、***类等)。
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PEG 化蛋白质的表征与分析

PEG 化蛋白质的检测与分析至少应该有三个方面

  1. 蛋白的平均修饰度

  2. PEG 修饰的位点及特定位点被修饰程度

  3. 不同修饰度的蛋白质的相对含量

    其中PEG 修饰的特定位点及特定位点被修饰程度的检测目前尚未见报道,现将几种常用的检测分析方法先容如下。

  1. 色谱法

    如果用色谱法可以将聚乙二醇反应后的混合物逐一分离,则可以绘制随浓度变化的工作曲线,根据工作曲线来为各个组分定性及定量,从而确定混合物的平均分子量和平均修饰度。但由于PEG 化蛋白质的多样性以及PEG 在溶液中影响蛋白质的色谱行为。色谱法分析并不是*好的分析方法,其分辨率很低,谱带宽且包含多种混合成分。另外由于蛋白质的多样性定性及定量也会有困难。Snider 等分别利用高效离子交换色谱,高效体积排阻色谱,高效反相液相色谱等对PEG-SOD作分析,结果显示其分辨率很低不能将各种分子逐一分析谱带宽且杂乱。 Mcgoff 用体积排阻色谱对PEG 化的SOD 进行分析,SOD 为一尖锐的峰而PEG 化的SOD 则为一宽峰,而且不能分离完全。但对于修饰位点少的蛋白质或多肽而言色谱法效果较好,如Brian Fenton等用RP-HPLC 对PEG-Hirudin(水蛭素)分析。由于水蛭素只有三个修饰位点,其产物较少,可以很清楚的看出有三个峰分别为PEG-Hirudin (PEG)2-Hirudin (PEG)3-Hirudin。凝胶渗透色谱(GPC)属于凝胶色谱的一种。凝胶色谱以多孔性填料为固相,填料上有许多大小不一的孔径,根据样品的尺寸大小实现分离,以有机溶剂(如甲苯四氢呋喃等)为流动相的称为凝胶渗透色谱,以水溶液为流动相的称为凝胶过滤色谱。有机相能很好地溶解大分子PEG。 Bullok 等用碱水解使蛋白质与PEG 分离,再对水解下来的PEG 进行凝胶渗透层析。通过测定PEG 的量以测修饰度。 但该方法可能因为水解不彻底和样品中含有游离的PEG 而受干扰。

  2. SDS-PAGE 凝胶电泳法

    凝胶电泳是蛋白质分析中十分常用的方法,其分辨率高且可以测定分子量。但该法在测定PEG 化蛋白质的分子量方面却存在很多缺陷。由于PEG 在蛋白质表面的屏蔽作用和PEG 分子与凝胶分子的缠绕作用使PEG化的蛋白质在凝胶中的迁移速度减慢,测出的分子量偏大。Kurfurst用常规的电泳法测定PEG 修饰后的水蛭素分子量,结果比理论值大一倍。用碘化钡将PEG染色根据PEG 标准曲线测定分子量,其值要准确的多。Kurfurst 还用等电聚焦法分析PEG 修饰后的水蛭素,证明有三种物质,Hirudin PEG-Hirudin (PEG)2-Hirudin。另外用毛细管区带电泳对PEG 化蛋白质的分析也屡见报道,由于蛋白质的疏水作用、静电作用和其它多种两相分配机制,毛细管中的蛋白质容易吸附在管壁上尤其是碱性蛋白质的静电吸附*为突出,这样使毛细管电泳的分离效率下降,峰高降低,甚至不出峰。为克服蛋白吸附,常采用化学方法来消除或覆盖。管壁上的硅羟基使石英表面转化成高分子涂层, Cunico等通过改性剂使毛细管柱内壁带正电荷,电渗流从通常的正极到负极方向变为负极到正极方,向减少了蛋白在毛细管内壁的吸附,同时也提高了分离度。

    3 分光光度法

    自从1960 年Satake 等先容用2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)法测定蛋白质氨基浓度以来,该方法已成为测蛋白质修饰度*常用的方法。TNBS 与蛋白质反应。蛋白质的赖氨酸残基的氨基末端进攻TNBS 的磺酸基,并将其取代形成的复合物有特定的光吸取以此测定其含量。该方法简单易行因此得到广泛应用但该方法存在如下缺陷(1)TNBS 与蛋白质反应受pH 影响较大,所以实验前应先测定*佳pH

    (2)对于较小的蛋白质,该方法**度不高。但Snyder 等在此基础上对TNBS 法进行改造,使该法**性又有所提高。Stock 等采用荧光胺法测定修饰度,荧光胺与蛋白质赖氨酸残基的氨基末端发生反应,生成的产物有特定的光吸取。通过测定蛋白质混合物所激发的荧光值来测定其平均修饰度,该方法灵敏性很高,仅需纳克级的蛋白质就能完成。但这类方法所用的PEG 衍生物较昂贵,不适于常规分析。

    4. 其它方法

    质谱法是测定物质结构的重要手段。近年来一种新型的质谱方法-基体辅助激光解析电离质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization MS, MALDI-MS)被成功地用于PEG 修饰蛋白组分的定性与定量分析。该质谱*大特点是可以分析高分子量的生物大分子,被测分子量可达50 万道尔顿。红外光谱也是鉴别化合物确定分子结构常用的手段之一。对单一组分或混合物中各组分也可以进行定量分析。由于拉曼散射光的频率位移对应于分子的能级跃迁, 因此拉曼光谱也成为人们研究分子结构新的手段之一。Bullock 等报道红外光谱测定,相对而言较为快速直接,不需要对样品进行预处理,可以根据C-O-C 键的吸取强度给聚乙二醇定量,但必须假设连接了SOD 和没有连接SOD 的聚乙二醇的C-O-C 键的吸取强度相同。另外由于红外光谱对PEG-SOD 中的PEG 没有特征吸取,所以游离PEG 的量需要用GPC 法检测并扣除,而且该方法确定修饰度还需要知道**的蛋白质含量,这也可能成为误差来源。拉曼光谱样品制作简单,检验灵敏但同红外光谱有相同的缺点,MALDI-MS 光谱与毛细管电泳谱十分相似,但**性比毛细管电泳差,而且与红外光谱和拉曼光谱有同样的缺点。

     

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