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上海芃硕生物科技有限企业 主营:PEG修饰剂;荧光染料;生化试剂(酶及酶底物、底物显色剂及色原、辅酶/核苷/碳水化合物、生物缓冲剂和季铵盐、表面活性剂、氨基酸及其衍生物、蛋白质类、维生素类、培养基类、***类等)。
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PEG 化蛋白质的分离纯化

PEG 修饰后的蛋白质是十分复杂的混合物,这是由于

(1)PEG 聚合物分子量分布较宽, 如PEG5000 的分子量分布在5000±250 道尔顿范围内

(2)由于被修饰蛋白质上待连接的活性位点的活性不同,空间位阻不同,导致每个蛋白分子上连接的PEG 数和PEG 连接的位置不同。如超氧化物歧化酶(SOD)有20 个可能的PEG 连接位点理论上大约有2020 种不同的反应产物

(3)活化的聚乙二醇中还残留未反应的活化剂,未活化的mPEG 等,因此经PEG 修饰后的蛋白质必须进行分离纯化。一般用色谱方法纯化PEG 化蛋白质。连接PEG 后蛋白质的分子量有了不同程度的提高,要想将其逐一分开,体积排阻色谱(SEC)就成了优选的方法。但SEC 分离同一数量级的物质效果不好,所以对于分子量小且修饰位点少的多肽和小分子蛋白质该方法也不是很理想。由于PEG为弱疏水性长链,连接PEG 后蛋白质分子的疏水性有所增强,所以也可以用反相高效液相色谱(RP-HPLC)分离,但其分离条件的摸索较为烦琐。再者由于连接了PEG,,蛋白质分子上的氨基等活性位点减少,其等电点pH 都发生了变化,所以用离子交换色谱(IEC)理论上也可以将其分离。Malik 等的研究表明PEG 化蛋白质的纯化难度很大,且纯化产量很低, Busby 和Ingham认为分离难度大的原因在于PEG 在水溶液中具有伸展构象,其流体动力学体积远远大于同样分子量的蛋白质。例如mPEG6000 不能通过截留分子量为12KD 的半透膜,在体积排阻色谱中PEG6000 的行为类似于分子量25 35KD 的球状蛋白质。 采用切割分子量为30000Da 或50000Da 的超滤膜过滤可有效去除mPEG ,但该方法不适用于小分子多肽。迄今为止常用的分离方法是先用超滤或透析去除咪唑等小分子活化剂残余物,然后再用各种色谱法分离。如 Snider 等用各种色谱法考察PEG-SOD 的多态性。 Mcgoff 等用体积排阻色谱和离子交换色谱对PEG-SOD 进行分离及分析。 唐微等先利用硫酸铵对反应后的混合物进行蛋白质沉淀,有效地去除了溶液中的PEG 然后再对离心出的蛋白质进行体积排阻色谱分离,分离效果较以前好, 但该方法同样也不适于小分子多肽,因为小分子多肽不容易被盐析沉淀。另外Zhao 等用异丙醇沉淀活化后的聚乙二醇分子可有效去除反应时的极性溶剂和副产物,活化聚乙二醇的收率达90%以上。

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